肌肉生长抑制素3′UTR基因突变通过阻断MSTN的翻译促进C2C12成肌细胞增殖和分化

肌肉生长抑制素(MSTN)的点突变可以产生特克塞尔羊的双肌肉表型。然而，其他物种是否具有与MSTN相同的作用方式，是否可以通过跨物种遗传编辑获得育种材料，目前尚不清楚。双荧光素酶报告系统证实，小鼠MSTN 3′ UTR突变可以为mmu-miR-1/206创建一个tar-get位点。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了MSTN 3′ UTR突变的C2C12细胞模型。然后分析突变C2C12细胞模型中MSTN的mRNA和蛋白表达。结果显示，突变阻断了MSTN的转运水平。通过抑制mmu-mir-206，MSTN蛋白在突变C2C12细胞中的低表达可以得到修复。此外，通过RT-PCR、CCK8分析、EDU (5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷)增殖分析、免疫荧光分析、Western blot和肌管融合统计等方法检测突变型C2C12细胞模型的增殖和分化能力。本研究可作为阐明MSTN功能和分子机制的参考，为准确的育种改良奠定基础。

1. 背景介绍

MSTN是肌肉生长的负调节因子。MSTN的缺失或失活增加了肌细胞的数量、肌纤维的直径和数量以及肌肉的过度发育。牛、羊、狗、老鼠和具有MSTN基因突变的个体都表现出“双重肌肉”特征。

在德克塞尔羊中，MSTN 3′UTR的g + 6723 G-A突变为miR-1和miR-206的结合位点。它引起MSTN的传递性抑制，这在德克塞尔羊中表现出双重肌肉效应。但目前对MSTN功能的研究大多是基于MSTN的整体淘汰或敲除。利用CRISPR/Cas9基因敲除绵羊基因组中的MSTN基因，获得了基因改造的绵羊，其产肉量显著提高。利用CRISPR/Cas9和Cre/LoxP获得了不含选择标记的MSTN基因敲除猪。MSTN基因敲除大鼠，山羊，狗和兔也已开发出来。以往对MSTN功能的研究主要集中在构建MSTN基因敲除的细胞或动物模型上。在这项研究中，改变了MSTN 3′UTR的四个连续碱基，导致MSTN表达减少。

2. 技术路线

3. 实验结果

C2C12细胞MSTN 3′ UTR突变位点设计的突变位点为mmu-miR-1和mmu-miR-206创建了结合位点。

图一. 小鼠MSTN 3′ UTR基因g + 6184-6187 TGCC-CATT突变为mmu-miR-1和mmu-miR-206的结合位点。(a)成熟miR-1和miR-206的多种同源序列，miRNA的种子区为黄色。比对序列之间的保守区域用星号表示。(b) g + 6184-6187 TGCC-CATT突变对C2C12细胞MSTN 3′ UTR中mmu-miR-1和mmu-miR-206碱基配对的影响。MSTN3′ UTR的种子匹配序列为黄色，突变为红色。比对序列之间的保守区域用星号表示。(c) mmu-miR-1和mmu-miR-206靶位预测及稳定性分析。Mfe代表最小自由能。(d)将野生型mstn3′ UTR-psiCHECK2和Mut-MSTN3′ UTR-psiCHECK2与NC (pCD513B-1)、mmu-mir-1-pcdhh和mmu-mir-206-pcdhh共转染HEK293T细胞，测定其荧光素酶活性。

最终获得了8个理想的阳性克隆。已经获得了预期的突变体C2C12细胞模型。

图二.CRISPR/Cas9介导的突变C2C12细胞模型(a)目标示意图。用红色箭头标记sgRNA的靶位点，位于MSTN 3′ UTR区域的下游。(b)采用T7E1分析法检测不同Cas9切割载体的切割效率。Fcut = (b + c)/(a + b + c).A是未切割DNA带的灰度值，b是从5′同源臂引入的。(d)突变型单克隆生长状态示意图(scale bar = 100μm)。(e)5′连接PCR (1.90 kb)和3′连接PCR (1.98 kb)证实了突变单克隆的精确整合。“NC”代表野生型C2C12。在单克隆抗体的MSTN 3′ UTR中发现了一个突变测序。突变序列是红色

RT-PCR结果(图3A)表明，突变体中MSTN的相对mRNA表达与野生型无明显差异。免疫荧光(图3B，c)和免疫印迹(图3D，e)结果表明，突变体的MSTN蛋白表达明显低于野生型。这些结果表明，C2C12细胞MSTN 3′ UTR突变抑制了MSTN的转运水平。

图3.MSTN在C2C12突变细胞模型中的表达分析。(a)野生型C2C12小鼠成肌细胞与突变型C2C12细胞MSTN mRNA表达的比较。MSTN mRNA在突变型C2C12细胞模型中的表达与野生型C2C12无明显差异。野生型C2C12小鼠成肌细胞和突变型C2C12细胞MSTN蛋白表达的免疫荧光染色比较。MSTN染色为红色，核染色为DAPI (蓝色)。(c)用IMAGEJ软件(50μm尺度条)分析MSTN的荧光强度。(d，e) Western blot比较MSTN蛋白在野生型C2C12小鼠成肌细胞和突变型C2C12细胞中的表达。MSTN蛋白在突变C2C12细胞模型中的表达明显低于野生型C2C12小鼠成肌细胞。

qRT-PCR结果表明，该抑制剂能显著降低mmu-miR-206的mRNA表达，模拟物及其前体表达载体能显著增加mmu-miR-206的mRNA表达。

在突变的C2C12细胞中，miR-206的抑制剂显著提高了MSTN的蛋白表达水平，而miR-206的模拟物和表达载体则显著抑制MSTN的蛋白表达。这些结果表明，mmu-miR-206可抑制突变C2C12细胞模型中MSTN的表达。

图4.Mmu-miR-206抑制突变C2C12细胞模型中MSTN的表达。(a)定量方法检测不同组织中miR-1和miR-206的相对mRNA表达。miR-1在小鼠骨骼肌和心肌中高表达，而miR-206在骨骼肌中特异表达。(b)用NC、抑制剂、模拟物和前体表达载体转染野生型和突变型C2C12细胞36h后，检测miR-206的相对mRNA表达水平。(c)将miR-206的NC、抑制剂、模拟物和前体表达载体转染野生型和突变型C2C12细胞36h后，用免疫荧光染色法(scale bar = 50μm)检测MSTN的相关蛋白表达。(d)用IMAGEJ软件对MSTN的荧光强度进行分析。(e，f)免疫印迹法检测MSTN的相对蛋白表达。miR-206的抑制剂能显著增加MSTN的蛋白表达，而mmu-miR-206的前体表达载体和模拟物能显著抑制MSTN的蛋白表达。

细胞增殖基因CDK2和Cy-clinD1的mRNA表达水平显著升高，而P21的mRNA表达水平显著降低。Cck8细胞增殖实验结果(图5B)表明，突变体的增殖能力明显高于野生型。细胞增殖实验(图5C，d)显示，突变型C2C12细胞中的EDU细胞百分比明显高于野生型。这些结果表明MSTN 3′ UTR突变促进了C2C12细胞的增殖能力。

图5. 突变型C2C12细胞模型的增殖分析。(a) RT-PCR检测细胞增殖相关基因(cyclin D1、CDK2、P21) mRNA表达水平的变化。用CCK8细胞增殖实验分析突变型C2C12细胞模型增殖的变化。突变型C2C12细胞模型24h后增殖能力明显高于野生型C2C12(* pb0.05)。(c)用EDU染色法检测突变型C2C12细胞模型的增殖能力。EDU染色呈红色，细胞核染色用DAPI染色(蓝色。(d)用IMAGEJ软件edu阳性细胞百分比。

肌源性调节因子的相对mRNA表达，突变型中MYOD、MYOG和MYHC的相对mRNA表达水平显著增加(图6A)。免疫荧光的结果表明突变体的MYOG蛋白表达水平明显高于野生型。在分化培养5天后，用免疫荧光法检测融合指数。突变体中MYHC蛋白表达水平显著高于野生型(图6E)。突变细胞的融合指数明显高于野生型(图6F)。这些结果表明，MSTN 3′ UTR突变促进了C2C12细胞的分化能力.

图6.突变型C2C12细胞模型的分化分析。(a) RT-PCR检测细胞分化相关基因(MYOD、MYOG、MYHC) mRNA表达水平的变化。(b) MYOG蛋白的表达用免疫荧光法检测。MYOG染色呈红色，细胞核用DAPI (蓝色)染色(100μm)。(c)用IMAGEJ软件分析MYOG的荧光密度。(d)比较野生型C2C12小鼠成肌细胞模型和突变型C2C12细胞模型的肌管数目，并进行免疫荧光染色。MYHC染色呈红色，细胞核用DAPI (蓝色)染色(标准杆= 50μm)。(e)用IMAGEJ软件分析MYHC的荧光强度。(f)分化培养5天后，突变型C2C12细胞模型的融合指数明显高于野生型C2C12成肌细胞模型。

4. 总结

结论： 成功地构建了一个MSTN突变的C2C12细胞模型。Mmu-mir-206对MSTN表达有抑制作用。

创新点：本研究利用CRISPR/Cas9技术对肌肉生长抑制素(MSTN)3′UTR区的4个连续碱基进行编辑，改变了MSTN的表达和C2C12的增殖分化能力。

意义：本研究可作为阐明MSTN功能和分子机制的参考，为准确的育种改良奠定基础。

文章链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813020303639