Wnt信号通路是多细胞生物中的重要通路，已被确定在细胞增殖、分化和体内平衡中起作用。在经典Wnt通路中，β-Catenin是核心成分，其蛋白质调控是Wnt信号通路中的关键过程。在没有Wnt的情况下，由Axin1、腺瘤性息肉病大肠杆菌(APC)和糖原合酶激酶3β (GSK3β)形成的破坏复合物使β-Catenin的N端磷酸化，后者又被βTrCP E3泛素连接酶识别和泛素化。泛素化β-Catenin被蛋白酶体降解，蛋白酶体调节基础β-Catenin水平。Wnt信号通路通过Wnt配体与受体复合物的结合而被激活，导致蓬乱(DVL)募集，其中DVL与Axin和破坏复合物的其余成分聚合。这种聚合使破坏复合物失活，诱导细胞质中的β-连环蛋白积累。积累的β-连环蛋白易位到细胞核并调节靶基因的转录。

WNK激酶是非典型的丝氨酸/苏氨酸激酶被许多物种中是保守的家族成员和包括四个成员。WNK是Wnt信号通路的积极调节者，然而，其详细的机制是未知的。该文章主要进一步研究了WNK和Wnt/β-catenin之间的关系。

在这里，我们证明了WNK是Wnt信号通路的正调节剂。WNK减弱了β-Catenin与葡萄糖诱导降解缺陷(GID)在这里，我们证明了WNK是Wnt信号通路的正调节剂。WNK减弱了β-Catenin与葡萄糖诱导降解缺陷(GID)复合物之间的相互作用，GID是β-Catenin的E3泛素连接酶，表明WNK可能调节β-Catenin水平。此外，我们发现WNK抑制剂也可作为Wnt抑制剂，抑制小鼠异种移植肿瘤的发展。这些发现表明WNK是β-Catenin的调节剂，可能是治疗癌症的靶点。

一、WNK是Wnt信号通路的积极调节者

首先检测了WNK是否与Wnt信号通路相互作用。可以看到Wnt靶基因AXIN2（早期反应基因）和c-Jun（晚期反应基因）的表达水平被Wnt刺激激活，但在siRNA敲除WNK1和WNK4后，AXIN2和c-Jun的表达显著降低（图1a）。这些结果表明，WNK是Wnt信号通路的积极调节者。WNK被认为是一种细胞质蛋白，因此接下来分析了WNK和DVL（Wnt信号通路最上游的细胞质成分）之间的关系。DVL1表达激活Wnt信号通路。WNK1和WNK4的敲除抑制了由DVL1表达激活的AXIN2和c-Jun的表达（图1b）。所有DVLs (DVL1、DVL2和DVL3)的外源性表达不能通过敲除WNK1和WNK4来挽救对AXIN2和c-Jun的wnt3a激活基因表达的抑制（图1c）。相反，使用siRNA敲除所有DVL基因抑制了由Wnt3a刺激激活的AXIN2和c-Jun的表达。且WNK1的外源表达通过DVL敲除挽救了这种抑制（图1d）。这些结果表明WNK1在Wnt信号通路中充当Dvl的下游元件。

二、WNK通过控制β-Catenin水平调节Wnt信号通路

接下来分析了WNK和β-连环蛋白在Wnt信号通路中的关系。β-Catenin的表达激活了Wnt信号通路的靶基因。WNK1和WNK4的敲除抑制了由β-连环蛋白表达激活的AXIN2和c-Jun的表达(图1e)。使用siRNA敲除β-Catenin抑制了由Wnt3a刺激激活的AXIN2和c-Jun的表达，而WNK1的外源性表达不能通过敲除β-Catenin来挽救这种抑制(图1f)。这些结果表明，WNK表达需要β-Catenin在Wnt信号传导中的功能。因此，接下来又研究了WNK是否调节β-Catenin水平。在正常条件下，β-Catenin通过蛋白酶体降解，在Wnt刺激后，β-Catenin在细胞质中积累。在正常条件和Wnt刺激条件下，敲除WNK1和WNK4都降低了β-Catenin水平(图1g)。蛋白酶体抑制剂MG132在两种条件下都阻断了β-Catenin的降解29(图1g)。此外，在敲除WNK1和WNK4之后，MG132仍然阻断β-Catenin的降解(图1g)。在MG132处理下，WNK1和WNK4的表达都降低了β-连环蛋白的泛素化水平(图1h)。这些结果表明，WNK通过调节β-Catenin的泛素化来调节β-Catenin水平。

图1：WNK是Wnt信号通路的正调节剂

三、WNK通过GID复合物参与β-Catenin的泛素化

WNK与β-Catenin泛素化有关，与正常的β-Catenin水平相似，β-CateninδN水平也通过敲除WNK1和WNK4而降低(图2a)。β-Catenin的其他组成型活性突变体，如β-Catenin S33Y和S45A的水平也降低了(图2a)。WNK1和WNK4的表达抑制了野生型β-Catenin的泛素化(图1g)。在APC缺失的人结直肠癌细胞系SW480中，β-Catenin不被破坏复合物降解。在SW480细胞中，WNK1和WNK4的敲除导致β-Catenin水平降低(图2b)。此外，敲除WNK1和WNK4引起的β-Catenin水平降低不能通过敲除SW480细胞中的βTrCP和FBXW11(也称为βTrCP2)来挽救(图2c)。这些结果表明，WNK与β-Catenin被含有βTrCP的破坏复合物泛素化无关。在SW480细胞中，使用siRNA通过敲除WNK1和WNK4来降低β-Catenin不能通过敲除SIAH1或SHPRH来挽救(图2d，e)。这些发现也表明SIAH1或SHPRH不参与WNK功能。通过敲除WNK1和WNK4降低β-Catenin可以通过敲除RMND5A和MAEA来挽救(图2f)。这些结果表明，GID复合物参与了与WNK功能相关的β-Catenin的泛素化。

图2：WNK通过GID复合物调节β-Catenin的蛋白质水平

四、WNK减弱β-Catenin和MAEA之间的相互作用

GID复合体的RMND5A和MAEA与WNK有关，通过免疫沉淀检查了WNK和RMND5A或MAEA之间的相互作用，发现RMND5A与WNK4相互作用(图3a)，MAEA与WNK1和WNK4相互作用(图3b)。MAEA与β-Catenin相互作用，但未检测到RMND5A(图3d，e)。WNK1和WNK4的表达降低了β-Catenin和MAEA之间的相互作用，但仅WNK1或WNK4的表达降低并未降低β-Catenin和MAEA之间的相互作用(图3d)。相比之下，敲除WNK1和/或WNK4增加了β-Catenin和MAEA的相互作用(图3e)。RMND5A和MAEA的表达都增加了β-连环蛋白的泛素化，并通过WNK表达挽救了β-连环蛋白泛素化的减少（图3f）。这些结果表明，WNK的存在减弱了β-Catenin和MAEA之间的相互作用，并通过GID复合物抑制了β-Catenin的泛素化。

图3：WNK减弱了β-Catenin和MAEA之间的相互作用

五、WNK抑制剂作为WNK-GID复合物相互作用的抑制剂

在WNK信号中，SPAK/OSR1是WNK的辅助因素和底物。因此，检查了这些抑制剂是否也降低了β-Catenin水平。在SW480细胞中，stock2s-26016(以下简称26016)降低了β-Catenin水平，但STOCK1S-50699(以下简称50699)没有(图4a)。在26016的存在下，由Wnt3a刺激激活的AXIN2和c-Jun在HEK293T细胞中的表达水平也受到抑制(图4b)。26016抑制了WNK1和WNK4的相互作用(图4c)，并且β-Catenin和MAEA之间的相互作用在26016处理下增加(图4d)，类似于WNK敲除的结果(图3e)。此外，用26016治疗增加了β-Catenin的泛素化水平(图4e)。这些结果表明，WNK抑制剂26016作为Wnt信号通路的抑制剂发挥作用，类似于WNK击倒的效果。26016的衍生物#13(以下称为#13)也降低了β-Catenin水平(图4f)。#13还抑制了WNK1和WNK4之间的相互作用(图4c)，增加了β-Catenin和MAEA之间的相互作用(图4d)，并抑制了由Wnt3a刺激激活的AXIN2和c-Jun的表达水平(图4g)。此外，#13增加了β-Catenin的泛素化水平(图4e)，表明26016和#13在WNK信号传导和β-连环蛋白降解方面具有相似的活性。此外，RMND5A和MAEA的敲除可以通过26016或#13的作用挽救降低的β-Catenin水平(分别见图4h，I)。WNK抑制剂抑制了WNK1和MAEA，或WNK4和MAEA之间的结合(分别见图4j、k)。这些结果表明，WNK抑制剂26016和#13作为WNK-GID复合物相互作用的抑制剂。

图4：WNK抑制剂起到Wnt抑制剂的作用

六、WNK可以调节直肠癌细胞中的β-Catenin水平

在结直肠癌细胞中，还检查了除了SW480细胞外，WNK对几种结直肠癌细胞系(DLD1和HCT116细胞)中β-Catenin水平的影响。与来自SW480细胞的数据一致，敲除WNK1和WNK4降低了DLD1和HCT116细胞中的β-Catenin水平(图5a)。通过敲除WNK1和WNK4导致的β-Catenin水平的降低被RNMD5A和MAEA显性-阴性形式的表达所挽救(图5b)。此外，在这些细胞中，WNK抑制剂26016和#13对β-Catenin的降低也通过RMND5AδR和MAEAδR得以恢复(图5c、d)。这些结果表明，WNK调节各种结直肠癌细胞的β-Catenin水平。

图5：WNK调节DLD1结直肠癌细胞中β-Catenin的蛋白质水平

七、WNK抑制剂诱导异种移植肿瘤生长消退

评估WNK抑制剂的抗肿瘤效果。用26016和#13处理SW480细胞，并测量细胞活力或生长。26016在24小时后有效诱导细胞死亡，而#13即使在高剂量下也仅轻微影响细胞死亡(图6a)。然而，#13引起细胞生长的显著抑制(图6b)。将SW480细胞皮下注射到免疫缺陷小鼠中，每周两次腹腔注射26016或#13，并监测肿瘤生长。在低剂量下观察到26016对异种移植物进展的影响很小或没有影响，但是在高剂量26016时，五只小鼠中有四只仅在两次注射后死亡(图6c)。这表明26016在体内的毒性比功效更严重。相比之下，#13的治疗以剂量依赖的方式导致肿瘤大小和重量减少，与载体注射的肿瘤结果相比(图6d，e)。此外，用#13治疗的肿瘤中β-Catenin的量以依赖于#13浓度和肿瘤大小的方式减少(图6f)。这些发现表明#13毒性低，并通过β-Catenin降解防止结直肠癌的发展。

图6：WNK抑制剂抑制结直肠癌细胞的异种移植发育

结论

WNK可以影响β-Catenin蛋白、泛素化和β-CateninδN水平，通过GID复合物调节β-Catenin水平。此外，WNK抑制剂可作为Wnt信号通路抑制剂起作用，且WNK是通过β-Catenin失调治疗癌症或其他疾病的潜在靶点。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s42003-020-01386-2