1.研究背景

中国鳖的雄性个体比雌性个体具有明显优势，例如更大的体型、更快的生长速度、更厚更宽的杯状肌和更少的体脂。其他水生动物，例如尼罗罗非鱼和比目鱼也具有典型的性二型性。尼罗罗非鱼：雄性比雌性生长速度快得多；比目鱼：雌性比目鱼（牙鲆）的体型和生长速度比雄性大得多。

在中华鳖中，外源激素雌二醇可导致雄性个体发生性别逆转，假雌性在性成熟后，可以与雄性杂交（ZZ），获得所有雄性后代。因此，雌雄性反转的研究是中国鳖全雄繁殖的基础，然而，中华鳖性转化的分子机制尚不清楚 。

已有研究证明，miRNA和lncRNA在哺乳动物受精、性别分化、配子发生和胚胎发生的各个步骤中发挥着重要作用。在目前的研究中，各种miRNA在硬骨鱼性腺的不同发育阶段都有影响，例如let-7a-1-5p、let-7c-5p和miR-92b-3p在精子中表达较高；miR-21-5p和miR-430b-3p在卵母细胞中的表达较高；miR-141和miR-429与睾丸发育和精子发生有关。在太平洋牡蛎中，lncRNA LOC105321313在其性腺早期分化过程中表现出性二型表达；在大黄鱼RNA测序中发现2782条在精巢、卵巢中差异表达的lncRNA。然而，miRNA和lncRNA对中国鳖性腺分化的分子机制尚不清楚。

2.研究目的

（1）探索miRNA与雄性、雌性和伪雌性之间的关系，为中华鳖的性别分化提供新的见解。此外，研究miRNA在中华鳖中的作用有助于改进养殖技术，促进水产养殖业的全面发展。

（2）通过构建相关网络，确定差异表达的lncRNA和蛋白质编码基因之间的相互作用。分析中华鳖中存在的性别特异性lncRNA，这些发现为lncRNAs在性别分化中的作用提供了新的见解，并为未来的研究提供了一组候选lncRNAs。

3. 材料与方法

4. 结果与分析

4.1.1通过E2处理获得假雌性中华鳖

（MicroRNAs May Play an Important Role in Sexual Reversal Process of Chinese Soft-Shelled Turtle, Pelodiscus sinensis）

E2处理可以引起雄性个体性反转，性反转比例为50.38%

4.1.2 Small RNA在雄性、雌性和伪雌性之间的分布和数量

雄性阅读量远远低于雌性和伪雌性，B、雄性组有更多的短片段C、雄性海龟中的miRNA数量明显少于伪雌性海龟，这些结果表明miRNA在性腺分化过程中起着重要作用。

4.1.3识别雄性、雌性和伪雌性的miRNA的特征

雌性和伪雌性个体的所有第一个核苷酸都是U，表明雄性、雌性和伪雌性中miRNA的每个核苷酸偏倚位置没有明显差异。而雄性个体缺乏长度超过27个核苷酸的miRNA，三组间miRNA的差异表明miRNA在性腺分化过程中起着重要作用。

4.1.4雄性、雌性和伪雌性（F、M和Z）的差异miRNA分析

在差异miRNA中，雄性和伪雌性之间差异miRNA的数量显著增加。

GO富集结果表明，在中华鳖由雄性转为雌性的过程中，靶基因主要富集在细胞过程、单体过程和生物调控等生物过程中。雄性和伪雌性之间差异miRNA的候选靶基因在分子功能中过度表达，如结合、催化活性和信号转导活性。

KEGG对雄性和伪雌性个体之间差异目标基因的分析表明，主要过程是运输和分解代谢、信号转导以及免疫和内分泌系统。

4.1.5差异miRNA的聚类分析和目标基因的验证

三组样本中共737个miRNA表达存在显著差异，miRNA表达模式的聚类图中，雌性和伪雌性的miRNA表达水平显著低于雄性，这些结果表明，miRNA可能在性反转过程中发挥重要作用。

4.1.6性腺相关miRNA部分靶基因的构建

miR-26a-5p在卵巢发育、破骨细胞刺激、破骨细胞相关和生长/分化等过程中发挥了重要作用。MiR-212-5p和MiR-202-5p参与卵巢或睾丸的发育。在卵母细胞成熟过程中，miR-301a发挥了重要作用。以上结果表明，这些miRNA和一些靶基因可能参与调节性逆转过程，包括卵巢发育和生长/分化。

4.2.1 lncRNAs和mRNAs的鉴定

（Screening and characterisation of sex differentiation-related long non-coding RNAs in Chinese soft-shell turtle (Pelodiscus sinensis)）

5994个lncRNA转录本，4463个（74.46%）是新的，39262个mRNA转录本，11833个新转录本，lncRNA比mRNA拥有更少的外显子，长度更短。

4.2.2 lncRNAs和mRNAs的性别特异性表达

这些差异表达的lncRNAs和mRNAs可能在中华鳖性腺形成中起关键作用

4.2.3差异表达lncRNAs和mRNAs的分析

与在雌性组织中检测到的水平相比，共有1369个lncRNA转录本在雄性组织中差异表达。其中278例上调，1091例下调（折叠变化）≥2.0，FDR<0.05；图3A）。火山图也显示了类似的趋势（图3B）。其中，15个性别分化相关的lncRNAs显示出最显著的差异表达，并被选择用于构建热图（图3C）。在失调的性别分化相关lncRNAs中，TCONS_00092301的下调幅度最大（log2（FC）-5.73649），TCONS_00068006的上调幅度最大（log2（FC）3.760947）。4374个mRNA在雄性组织中的表达与在雌性组织中检测到的水平相比存在显著差异（1907个上调，2467个下调（图3D和补充文件S2）。在火山图（褶皱变化）中观察到了类似的mRNA差异表达趋势≥2.0，FDR<0.05（图3E）。其中，15个性别分化相关的mRNAs显示了最显著的差异表达，被选择用于构建热图（图3F）。在失调的性别分化相关mRNA中，XM_014578590.1是上调最多的（log2（FC）-9.5411），XM_006133089.2是下调最多的log2（FC）9.41996）

4.2.4 lncRNAs的假定靶基因

本研究使用顺式和反式模型预测了lncRNA的靶基因，研究lncRNA差异对中华鳖性别分化功能调节的影响，发现许多lncRNAs被预测以DMRT1、CYP19a等性别分化相关基因为靶标。

4.2.5 lncRNA和mRNA相互作用网络

相关网络由63个lncRNAs和185个与性别分化相关失调基因相关的mRNA构建而成。对该网络的回顾表明，lncRNAs以顺式或反式调节靶基因。例如，PC基因XM_006112508.2在cis中被lncRNA TCONS_00071083靶向，而PC基因XM_014572620.1在反式中被lncRNA TCONS_00039123和TCONS_00039122靶向。有趣的是，PC基因XM_006139628.2在顺式和反式中受lncRNA TCONS_00002327和TCONS_00019442的调节。此外，与PC基因相关的lncRNA采用了多种途径，包括一个lncRNA与一个PC基因相关，一个lncRNA与多个PC基因相关，以及多个lncRNA与一个PC基因相关。Dmrt1（XM_006137866.2）、gata4（XM_014569886.1）和cyp19a（XM_006135075.2）已被确定为关键的性别分化相关基因2，并被证明受网络中顺式或反式的几个lncRNAs肌动蛋白调控。因此，lncRNAs和mRNAs的相关网络表明，lncRNAs在中国软壳龟性别分化过程中以顺式和反式作用于PC基因。

4.2.6差异表达lncRNAs和mRNAs的验证

结果证实了两种lncRNA转录本和编码转录本的一致表达模式，表明用于识别假定lncRNA的过程足够严格，可以与体内表达的大多数已识别lncRNA相关联。

5. 结论

1）Small RNA和miRNA的结果表明，E2诱导的假雌性个体尽管基因型没有改变，但相似的特征已经改变，趋向雌性。

2）六种miRNA，如miR-26a-5p、miR-212-5p、miR-301a、miR-202-5p、miR-181b-3p和miR-96-5p，被鉴定为与性逆转过程密切相关，它们可能是进一步研究miRNA在中华鳖性二型性中生物学功能的重要候选基因。

3）同时，此研究也为性反转的分子机制研究提供了方向。

4）lncRNAs在中华鳖性别分化中的发挥重要作用，此外，对假定的lncRNA的鉴定和注释为进一步阐明lncRNA在该物种性别决定中调节mRNA表达的机制提供了基础。

文章链接:

(1)https://doi.org/10.3390/genes12111696

(2)https://doi.org/10.1038/s41598-018-26841-3