运用BrdU标记法检测细胞增殖
发布时间:2017-12-10浏览次数:258

导语

直接测定DNA合成是细胞增殖检测的最准确方法之一,是测定物质毒性、评估药物安全评价、细胞健康的基本方法,其中常用的方法有BrdU标记法。

原理:

BrdU预处理的细胞中,BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中,而且这种置换可以稳定存在,并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后,可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量(如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记,最后用比色法或荧光的方法进行定量测定),从而判断细胞的增殖能力。

操作步骤:

(1)细胞以1.5×105/ml细胞数接种于直径35 mm培养皿中(内放置一盖玻片),培养1 d,用含0.4% FBS培养液同步化3 d,使绝大多数细胞处于G0期。

(2)加入BrdU(储液:1.0 mg/ml,终浓度为0.03 μg/ml),37℃,孵育40 min。

(3)弃培养液,玻片用PBS洗涤3次。

(4)甲醇/醋酸固定10 min。

(5)经固定的玻片空气干燥,0.3% H2O2-甲醇30 min灭活内源性氧化酶。

(6)5%正常兔血清封闭。

(7)甲酰胺100℃,5 min变性核酸。

(8)冰浴冷却后PBS洗涤,加1抗即抗小鼠BrdU单抗(工作浓度1:50),阴性对照加PBS或血清。

(9)按ABC法进行检测,苏木素或伊红衬染,在显微镜下随机计数10个高倍视野中细胞总数及BrdU阳性细胞数,计算标记指数(LI)。

注意事项:

1.BrdU配制方法:10 mg溶于10 ml双蒸水,4℃下避光保存

2.BrdU会肌体造成不可逆损伤,使用时注意安全,避免吸入BrdU粉尘。


摘自细胞之邦(微信:bbs-abbiomall


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