5'-RACE的操作步骤
1.引物：
1.1通用引物：
Primer |
5’-3’ sequences |
Purpose |
AP |
GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)16 |
Adaptor primers |
AUAP |
GGCCACGCGTCGACTAGTAC |
Adaptor primers |
AAP |
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGⅡGGGⅡGGGⅡG |
Adaptor primers |
1.2基因特异性引物
根据已获得cDNA的部分序列，设计三条基因特异性引物，两两之间间隔大于100 bp,以便于判断扩增片段的大小之差是否与预期相符。
注意：三条引物为反向引物
5R3 5R2 5R1AAAAAA---
2.制备用于5'-RACE的cDNA模板
2.1cDNA第一条链的合成
提取RNA，用oligo(dT)为引物合成cDNA第一条链。
2.2cDNA第一条链的纯化
用胶回收试剂盒E.Z.N.A®Gel Extraction Kit纯化cDNA第一条链，步骤如下：
（1）将两管cDNA混合(约40μl)，并加入到120μlBinding buffer中，混匀后转移至装配好收集管的HiBind分离柱中，13,000 g室温离心1 min。
（2）弃收集管中的滤出液，加入120μlBinding buffer，13,000g室温离心1 min。
（3）弃收集管中的滤出液，加入700μlDNA Wshing buffer，静置2-3 min，10,000 g离心1 min。重复此步骤一次。
（4）弃收集管中的滤出液，室温空管离心13,000 g, 1 min。
（5）将分离柱放入干净的1.5 ml离心管中，加入25μl灭菌水(65℃预热)，室温静置5 min，10,000 g离心1 min，收集DNA洗脱液。
注：也可用其它胶回收试剂盒，操作步骤参考说明书进行调整
2.3cDNA第一条链的3'端添加ploy C
参考根据TakaRa TdT(末端脱氧核糖核酸转移酶)说明书，并略有修改，在cDNA第一条链的3’末端添加poly C。反应体系及程序如下表：
步骤 |
组分 |
体积(μl) |
反应程序 |
1 |
已纯化的cDNA第一条链 |
10 |
|
|
5×TdT Buffer |
5 |
|
|
10 mM dCTP |
0.5 |
混匀，瞬时离心 |
|
灭菌水 |
6 |
94℃5 min，冰上2 min |
2 |
第1步产物 |
21.5 |
|
|
0.1% BSA |
2.5 |
混匀，瞬时离心 |
|
TdT(14 U/μl) |
1.0 |
37℃20 min，70℃10 min |
3.嵌套PCR
第一轮PCR中，模板为3'端已添加ploy C的cDNA第一条链。引物为5R1+AAP和5R2+AAP；然后以各自稀释50-100倍的第一轮PCR产物为模板，以5R2+AUAP和5R3+AUAP引物对进行第二轮嵌套PCR。
3'-RACE的操作步骤
1.引物：
1.1通用引物：
同5'-RACE。
1.2基因特异性引物
根据已获得cDNA的部分序列，设计三条基因特异性引物，两两之间间隔大于100 bp,以便于判断扩增片段的大小之差是否与预期相符。
注意：三条引物为正向引物
3F1 3F2 3F3AAAAAA---
2.制备用于3'-RACE的cDNA模板
提取RNA，用AP为引物合成cDNA第一条链。
3.嵌套PCR
第一轮PCR中，模板使用以AP为引物合成cDNA第一条链。引物为3F1+AAP和3F2+AAP；然后以各自稀释50-100倍的第一轮PCR产物为模板，以3F2+AUAP和3F3+AUAP引物对进行第二轮嵌套PCR。
建议进行RACE时：
1.使用新提取的RNA合成cDNA第一条链
2.使用目的基因表达量最高的组织
