作物中许多重要农艺性状的改变是由单个碱基变异引起的。通过将腺嘌呤或胞嘧啶脱氨酶与Cas9缺刻酶（Cas9n）融合而成的腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和胞嘧啶碱基编辑器（CBEs），能在不产生DNA双链断裂且不需要供体模板的情况下对编辑窗口内（一般为距离PAM远端起的第4-8位）的腺嘌呤或胞嘧啶脱氨，分别实现A-G（T-C）或C-T（G-A）的碱基精准替换，为功能基因组研究和作物遗传改良提供了有效工具【1】。

近日，华南农业大学生命科学学院、亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室和岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士/祝钦泷研究员团队在Plant Biotechnology Journal在线发表了题为PhieABEs: a PAM-less/free high-efficiency adenine base editor toolbox with wide target scope in plants的研究论文，利用高活性腺嘌呤脱氨酶、单链DNA结合结构域（DBD）与广靶向的SpCas9变体，成功开发出一套几乎无PAM限制的高效广靶向植物腺嘌呤碱基编辑器PhieABEs（Plant high-efficiency ABEs）。

目前广泛使用的ABE7.10系统在植物细胞中的编辑效率普遍很低【2】，而最近基于新型腺嘌呤脱氨酶TadA8e开发的ABE8e系统在一定程度上提高了植物单碱基编辑效率【3, 4】，但仍缺乏在多个代表性靶点中对其稳定性和靶序列偏好性进行系统分析。来自人源Rad51蛋白非序列特异性的ssDNA结合结构域（DBD），对解旋后的DNA单链具有稳定作用【5】，但其与ABE系统的兼容性如何，以及能否提高碱基编辑系统的活性并扩增编辑窗口，均是未知的。此外，目前大多数碱基编辑系统使用融合识别NGG-PAM的SpCas9n变体，其基因组靶点的选择自由度受到很大的限制【3】。

刘耀光院士/祝钦泷研究员团队根据水稻密码子偏好性重新优化了TadA8e、DBD的核苷酸序列，并将其分别与两种识别NGN-PAM（PAM-less）的SpCas9n缺刻酶变体编码基因SpCas9n-NG和SpGn，以及一种识别NNN-PAM（PAM-free）的SpCas9n缺刻酶变体编码基因SpRYn融合，构建了三个高效的植物腺嘌呤单碱基编辑器PhieABEs（hyABE8e-NG、hyABE8e-SpG和hyABE8e-SpRY）。在29个具有不同PAM类型（含有NGN-PAM或NHN-PAM，其中H为A，T或C）的水稻基因组靶点中对这些PhieABEs进行了系统性的编辑效率和特征测试，并与普通ABE8e（不含DBD）系统进行比较。结果表明，在17个测试的NGN-PAM靶点中，PhieABEs的平均编辑效率为67.8%–78.5%，编辑窗口为A1–A14，相较于ABE7.10（平均效率为2.6%，编辑窗口为A4–A8）和普通ABE8e系统（平均效率为46.7%–59.7%，编辑窗口为A3–A14）均有显著的提高和扩展，特别是在A9–A14这些更靠近PAM的腺嘌呤碱基中（比普通ABE8e提高了7.98倍），且无靶序列偏好性。其中，hyABE8e-SpRY表现最为突出，在测试的靶点中（包含除上述NGN-PAM靶点外的12个NHN-PAM靶点）展现出较高的编辑活性（在7个靶点中表现出100%的编辑效率）、几乎无PAM限制的靶点识别能力、较广的编辑窗口（A1–A13）、较低的T-DNA自靶向突变率（在NGN-PAM靶点中为16.9%，在NHN-PAM靶点中为11.9%）且不产生sgRNA依赖的脱靶效应。此外，一种进化的sgRNA（esgRNA）被用作降低SpRYn引起的T-DNA自编辑效应，但其似乎与PhieABE系统并不兼容。

普通ABE8es与PhieABEs载体结构（a）及在NGN-PAM靶点中的编辑效率（b）

普通ABE8es与PhieABEs在NGN-PAM靶点中的PAM偏好性（a）、突变类型（b）、编辑活性窗口（c）、A碱基5’与3’端碱基的位点偏好性分析（d和e）、T-DNA自靶向（f）与sgRNA依赖的脱靶效应（g）比较。

综上，该研究开发的PhieABEs（特别是hyABE8e-SpRY）具有高效、几乎无PAM限制的靶点识别能力、编辑窗口广、无靶序列偏好性、自靶向和脱靶效率低等优点，与此前团队开发的PhieCBEs系统【6】，一并能被广泛地应用于基因功能研究、基因饱和突变、引入或消除终止密码子和可变剪接等研究。

刘耀光院士/祝钦泷研究员团队近年来在植物合成生物学工具系统与基因组编辑技术开发与应用研究中取得了一系列进展，开发了植物合成生物的重要工具多基因叠加系统TGSII，并创制了首个胚乳富含花青素与虾青素的“紫晶米”与“赤晶米”水稻新种质（Zhu et al., Mol Plant, 2017；Zhu et al., Mol Plant, 2018）；同时还开发了广靶向基因组与单碱基的编辑系统（Zeng et al., Plant Biotechnol J, 2020a; Tan et al., Plant Biotechnol J, 2020; Zeng et al., Mol Plant, 2020; Tan et al., Plant Biotechnol J, 2022），并创制直链淀粉含量适宜的品质优异的水稻新种质（Zeng et al., Plant Biotechnol J, 2020b; Liu et al., J Integr Plant Biol, 2021）。该研究为植物功能基因组研究和作物遗传改良提供了实用的工具，对其他编辑系统的改良具有重要的参考意义。博士后谭健韬和曾栋昌，博士生赵延昌为论文的共同第一作者，祝钦泷研究员为论文的通讯作者。刘耀光院士参与了相关研究工作。该研究得到了广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金、广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项和中国博士后基金的资助。

参考文献

1. Rees, H.A., and Liu, D.R. (2018) Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells. Nat Rev Genet 19, 770-788.

2. Zeng, D., Li, X., Huang, J., Li, Y., Cai, S., Yu, W., Li, Y., Huang, Y., Xie, X., Gong, Q., Tan, J., Zheng, Z., Guo, M., Liu, Y.G., and Zhu, Q. (2020) Engineered Cas9 variant tools expand targeting scope of genome and base editing in rice. Plant Biotechnol J 18, 1348-1350.

3. Li, J., Xu, R., Qin, R., Liu, X., Kong, F., and Wei, P. (2021) Genome editing mediated by SpCas9 variants with broad non-canonical PAM compatibility in plants. Mol Plant 14, 352-360.

4. Yan, D., Ren, B., Liu, L., Yan, F., Li, S., Wang, G., Sun, W., Zhou, X., and Zhou, H. (2021) High-efficiency and multiplex adenine base editing in plants using new TadA variants. Mol Plant 14, 722-731.

5. Zhang, X., Chen, L., Zhu, B., Wang, L., Chen, C., Hong, M., Huang, Y., Li, H., Han, H., Cai, B., Yu, W., Yin, S., Yang, L., Yang, Z., Liu, M., Zhang, Y., Mao, Z., Wu, Y., Liu, M., and Li, D. (2020) Increasing the efficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of a single-stranded DNA-binding protein domain. Nat Cell Biol 22, 740-750.

6. Zeng, D., Liu, T., Tan, J., Zhang, Y., Zheng, Z., Wang, B., Zhou, D., Xie, X., Guo, M., Liu, Y.G., and Zhu, Q. (2020) PhieCBEs: Plant High-Efficiency Cytidine Base Editors with Expanded Target Range. Mol Plant 13, 1666-1669.

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13774