核DNA和线粒体DNA（mtDNA）中的碱基编辑在生物医学研究和生物技术中广泛应用。2022年1月18日，Nature Communications在线发表了题为“Nuclear and mitochondrial DNA editing in human cells with zinc fifinger deaminases”的研究论文。在本研究中，作者开发了一个称为锌指脱氨酶（ZFDs）的碱基编辑平台，由锌指DNA结合蛋白、分裂细菌间毒素脱氨酶DddAtox和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）组成，催化靶向C-to-T的转变，而不会在人类细胞中诱导不必要的插入和缺失（indel）。通过使用ZFD体系，实现了在核DNA中60%和mtDNA中30%的碱基编辑效率。ZFD与基于CRISPR的碱基编辑器不同，它不会切割DNA产生单链或双链断裂。此外，该研究在大肠杆菌中表达并纯化的重组ZFD蛋白可以自发穿透培养的人类细胞实现诱导靶向碱基转变。 目前在真核细胞和生物体中应用的基因组编辑工具越来越多，包括但不限于锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活物样效应物（TALE）核酸酶（TALENs）、基于TALE和DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（又称DdCBEs）、CRISPR-Cas9。原则上，这些工具由两个功能单元组成：DNA结合部分和催化部分。因此，锌指阵列或TALE阵列作为DNA结合部分发挥作用，核酸酶（ZFNs和TALENs中的FokI）或脱氨酶（DdCBEs中的分离的DddAtox或CBEs中的APOBEC1）作为催化单元发挥作用。CRISPR-Cas9既是一种核酸酶，也是一种RNA引导的DNA结合蛋白。Cas9在靶标位置切割双链DNA，通过体内的修复机制会导致靶位上不必要的大片段缺失、p53激活和染色体重排。相反，胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器（CBEs和ABEs）不会产生DSB，从而避免细胞中一些不必要的indel，并且在没有修复模板或供体DNA的情况下可以有效催化单核苷酸转变。值得注意的是，CBE和ABE中的nCas9仍会切割DNA单链，这依旧会在靶标位点产生一些不必要的indel。 已有研究报道，源自Burkholderia cenocepacia的脱氨酶毒素DddAtox可以分离并融合到TALE阵列和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）中形成DdCBEs，其催化哺乳动物细胞核DNA和线粒体DNA（mtDNA）中的C-to-T碱基转化。作者前期通过使用特定的DdCBEs分别在在小鼠中实现了线粒体DNA编辑，在植物中实现了叶绿体DNA编辑。 相较于TALE和SpCas9，ZFN的尺寸较小，可以很容易地包装在病毒载体中用于体内研究和基因治疗应用。同时，与TALE不同的是，锌指在C端和N端都缺少大块的结构域，这使得它们具有一定的友好性：分裂的DddAtox可以融合到ZFP的任一端。此外，具有内在细胞穿透活性的ZFPs可能允许在人类细胞中进行无核酸基因编辑。这些特性使ZFPs成为核和细胞器DNA碱基编辑的理想平台。因此，作者尝试将DddAtox与特定的锌指蛋白（ZFPs）融合起来，在人类和其他真核细胞中创建锌指脱氨酶（ZFDs），用于无indel、精确的碱基编辑。 作者首先对ZFD的体系结构进行优化。第一步是优化连接ZFP和拆分DddAtox半体的氨基酸（AA）linker的长度以及在左右ZFP结合位点之间诱导C-To-T转换的spacer的长度。针对以上两个方面设计了一系列载体（图1a，b），因为DddAtox可以在G1333和G1397两个位置发生分裂，并且每一半都可以融合到左或右ZFP上。所以作者针对每个载体分别测量了24种（=6个linker×2个分裂位置×2个可能的融合（左或右）ZFD的碱基编辑效率。结果发现linker长度为2-AA和5-AA的ZFD结构效率低下，linker长度至少为10-AA时ZFD结构可以诱导C-to-T转化，24AA-linker显示出最高的编辑效率。当右ZFD与左ZFD与相同的24-AAlinker连接时，右ZFD与24-AAlinker最为活跃。我们还发现，在G1397使用DddAtox拆分的ZFD比在G1333使用DddAtox拆分的ZFD更有效（图1c）。综上优化，当基于spacer长度在7-21 bp时碱基编辑效率效率>6.8%。

图1 ZFDs结构的优化

紧接着，作者利用该系统测试在内源性靶标位点的编辑效率。作者采用了带有24-AA linker的ZFD，靶向8个基因中的11个位点（每个位点两对ZFD），检测ZFD是否能够催化人类细胞内源性染色体靶位发生C-to-T（图2）。在HEK 293 T细胞中，这些ZFD的C-to-T碱基编辑效率在1.0%到60%之间，而indel很少被诱导，仅显示<0.4%（图2b）。其中两对带有5-bpspaer的ZFD效率很低，其他20个ZFD对至少7bp spacer的靶标平均编辑频率为12±3.4%，与基于Cas9的碱基编辑器一致。除了TC中的胞嘧啶外，AC和GCC中的胞嘧啶也可以转化为胸腺嘧啶，但效率较低（图2c-f）。将纯化的重组基因编辑酶（而不是编码它们的质粒DNA）输送到细胞中可以减少非靶向效应，避免针对外源DNA的先天免疫反应，并排除质粒DNA片段整合到基因组中的可能性。已有研究证明ZFPs可以在体内和体外自发渗透到哺乳动物细胞中。为了证明ZFD蛋白在培养的人类细胞中介导的碱基编辑，作者选择了针对TRAC位点的高活性ZFD对（TRAC-NC），并从大肠杆菌中纯化了含有一个或四个核定位信号（NLS）拷贝的重组TRAC-NC蛋白。通过体外评估ZFD蛋白的脱氨酶活性和使用尿嘧啶特异性切除试剂（USER）处理后，发现它们具有高度活性和有效的DNA切割活性。利用电穿孔法将纯化的ZFD蛋白直接输送到人类细胞中，发生了高达27%的靶向C-to-T转化（图2g）。综上，这些结果表明，编码ZFD的质粒或纯化的重组ZFD蛋白可用于人类细胞核DNA的碱基编辑。

图2 ZFDs在内源性靶位点编辑胞嘧啶碱基

DddAtox与基于CRISPR的系统不同，这些可编程脱氨酶可用于编辑细胞器DNA，包括线粒体mtDNA和叶绿体DNA。因此，作者构建了靶向线粒体的mitoZFDs质粒，在HEK 293 T细胞的线粒体中实现了2.6-30%的编辑效率（图3a）。有趣的是，与CC配置（CC-ZFDs）（7±2%，n=6）相比，NC配置（NC-ZFDs）的mitoZFDs效率更高（13±3%，n=12）（这并不意味着NC ZFD总体上优于CC ZFD，因为NC ZFD和CC ZFD中使用了不同的ZFP）。

图3 利用mitoZFDs对线粒体DNA编辑

最后，作者评估了ZFDs的线粒体全基因组靶特异性。将编码这些ZFD对的可变量（5–500 ng）mRNA或质粒转染到HEK 293 T细胞中，发现标靶编辑效率具有一定的剂量依赖性。高剂量（100、200和500ng）的mRNA或质粒产生了>30%的靶向C-to-T编辑，但在线粒体基因组中也引起了数百次>1.0%的非靶向编辑。低剂量（5和10ng）的mRNA或质粒在很大程度上避免了这些非靶向编辑，但显著降低了靶向突变频率。中等剂量（50ng）的mRNA是最佳选择，避免了脱靶编辑，同时保持了较高的靶点编辑效率。 为了进一步消除非靶点编辑，作者在ZFDs中的每个锌指中加入R（-5）Q突变，以去除非特异性DNA接触。与未经处理的mtDNA相比，产生的ZFD变体对保留了较高的靶向活性，并显示出高度的特异性，几乎没有偏离靶向编辑。特别是，当使用带有R（-5）Q突变的50 ng mRNA的mitoZFD时，与使用200 ng WT mRNA的mitoZFD相比特异性提高了8.2倍（图5）。

图5 提高线粒体全基因组靶向特异性

综上，在这项研究中，作者提出了一种新的碱基编辑器ZFDs，由锌指DNA结合阵列和DddAtox组成。与DdCBE相比，ZFDs中的ZFP结构紧凑，所以尺寸更小，而DdCBE中的TALE阵列体积庞大。紧凑型ZFP具有工程化友好性，可以将分裂的DddAtox融合到ZFP的C或N末端，从而产生ZFP结合位点上游或下游的ZFD。此外，重组ZFD蛋白可以在无电穿孔或脂质体感染的情况下自发渗透到人类细胞中，这些特性将使ZFDs成为建模和治疗线粒体疾病的强大平台。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-022-27962-0.pdf