Eur Respir J | 甲基化-CpG结合域2通过诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化来促进肺纤维化

DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，在调控基因表达中起着至关重要的作用。特发性肺纤维化（IPF）是一种慢性、进行性的纤维化性肺病，是由遗传和环境因素之间复杂的相互作用引起的。通常，IPF以上皮损伤和侵袭性成纤维细胞的分化为特征，其中，成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化起到了至关重要的作用。前期研究证实DNA甲基化参与了IPF的病理进程，然而其具体机制尚未完全阐明。

华中科技大学同济医学院附属同济医院，国家卫生中心呼吸与危重症医学科在2022年1月27日于European Respiratory Journal上发表了题为The methyl-CpG-binding domain 2 facilitates pulmonary fibrosis by orchestrating fibroblast to myofibroblast differentiation的文章，阐释了甲基化CpG结合域2（methyl-CpG-bingding domain 2, MBD2）通过结合甲基化的CpG位点，调控下游基因的转录，从而影响纤维化进程。

Fig 1：作者首先通过Western Blot测定IPF患者及博来霉素诱导肺纤维化小鼠的肺组织匀浆中MBD2的含量。结果表明，在IPF肺组织中，MBD2表达量与对照组相比升高了7倍，同时肌成纤维细胞标志物α-SMA也明显升高。在肺纤维化的小鼠组织中也得到了相似的结果。为了进一步验证这个结果，作者用TGF-β刺激小鼠肺原代成纤维细胞分化，同样显示MBD2表达升高。鉴于MBD2是通过识别DNA甲基化发挥功能，作者接下来检测了人与小鼠肺组织中的DNA甲基化水平，结果表明，在IPF患者与肺纤维化小鼠的整肺中，DNA甲基化水平明显下降。

Fig 2：作者采用Western Blot对TGF-β诱导的原代肺成纤维细胞进行检测，证实TGF-β剂量依赖性地诱导MBD2的表达。为验证该现象是否依赖于经典的TGF-β-Smad通路，作者通过免疫荧光检测了MBD2与磷酸化的Smad2和Smad3，发现在TGF-β诱导分化的肌成纤维细胞中，二者均与MBD2有明显的共定位。该结果提示MBD2可能位于TGF-β-Smad信号通路的下游。为验证这一推测，作者分别用TβR1（TGF-β receptor 1）的选择性阻断剂SB431542，和Smad3选择性阻断剂SIS3-HCl处理TGF-β诱导后的原代成纤维细胞。TGF-β诱导后，纤连蛋白和α-SMA均显著升高，而上述两种阻断剂均可抑制二者的上调。

Fig 3：作者使用TGF-β处理正常和Mbd2敲除的肺成纤维细胞后，分别采用Western Blot和RT-PCR检测其中的纤维化指标。结果证实，Mbd2敲除可显著降低纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达。与该结果相一致的是，TGF-β诱导的成纤维细胞中MBD2表达呈时间依赖性升高，且与纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达高度相关。不仅如此，在从IPF患者肺组织中分离的成纤维细胞中使用siRNA沉默MBD2后，纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA的表达均被抑制。

Fig 4：为进一步证实MBD2在体内的作用，作者利用Cre-loxP系统分别构建了由他莫昔芬诱导的成纤维细胞与肌成纤维细胞内Mbd2条件性敲除小鼠。在成纤维细胞条件性敲除Mbd2的小鼠中，从博来霉素诱导前第12天开始，连续五天腹腔注射他莫昔芬来诱导MBD2缺乏，免疫荧光显示Collage Ⅰ阳性细胞中MBD2缺乏。HE染色和Masson染色结果表明，成纤维细胞中Mbd2敲除显著抑制了博来霉素诱导的肺纤维化。Western Blot和RT-PCR结果证实，Mbd2敲除的小鼠肺中纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA水平均低于野生型小鼠。

Fig 5：利用Cre-loxP系统构建肌成纤维细胞Mbd2条件性敲除小鼠，腹腔注射他莫昔芬后用博来霉素诱导肺纤维化。免疫荧光结果证实了α-SMA阳性的肌成纤维细胞中MBD2缺乏。HE染色和Masson染色结果表明，Mbd2敲除显著抑制了博来霉素诱导的肺纤维化。Western Blot和RT-PCR结果证实，Mbd2敲除的小鼠肺中纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA水平均低于野生型小鼠。

Fig 6：为进一步确定MBD2抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的机制，作者用TGF-β刺激Mbd2敲除的成纤维细胞，研究下游信号分子。Western Blot结果证实，Mbd2敲除可显著抑制磷酸化Smad2和Smad3的表达，而RT-PCR结果显示，Mbd2敲除对TGF-β通路的抑制因子Smad7没有显著影响，Smad特异性E3泛素化蛋白连接酶1和2的mRNA水平也没有明显变化。因此推测，在肺成纤维细胞中，TGF-β-Smad通路与Mbd2的表达之间可能存在正反馈调节。

作者接下来使用RNA-Seq来分析野生型和Mbd2敲除的肺成纤维细胞中与分化相关的基因的表达模式。结果发现，与Mbd2敲除的成纤维细胞相比，野生型肺成纤维细胞中有1276个mRNA、418个lncRNA和1个ncRNA呈现上调，1001个mRNA、185个lncRNA和2个ncRNA呈现下调。其中，Erdr1，一种压力相关的生存因子在Mbd2敲除的成纤维细胞中明显上调。该基因曾被报道在类风湿性关节炎中抑制滑膜成纤维细胞的迁移。RT-PCR结果证实，TGF-β诱导野生型成纤维细胞后，Erdr1 mRNA水平降低了8倍，而与之相比，Mbd2敲除的成纤维细胞中，Erdr1 mRNA水平则升高了6.5倍。鉴于MBD2是通过识别DNA甲基化发挥功能，作者分别检测了基因组DNA和Erdr1启动子的甲基化水平。结果证实，无论在野生型还是Mbd2敲除的成纤维细胞中，TGF-β诱导均可导致基因组DNA甲基化明显升高。利用生信分析，作者预测到Erdr1的启动子内包含一个CpG岛，且亚硫酸盐测序显示在-896bp ~ -842bp区域存在高水平的甲基化。接下来，作者通过ChIP-PCR来验证MBD2是否通过识别并结合Erdr1启动子中上述区域的甲基化位点来调控其转录。结果表明，MBD2结合了Erdr1启动子上-954 bp ~ -682 bp区域，而上述高甲基化的区域（-896bp ~ -842bp）包含在内。为进一步验证，作者构建了-896bp ~ -842bp区域无CpG位点的突变质粒并采用荧光素酶报告基因检测Erdr1表达水平，结果证实包含突变质粒的肌成纤维细胞中Erdr1的表达水平明显高于包含野生型质粒的细胞。

Fig 7：接下来作者研究了Erdr1在成纤维细胞分化中的作用。免疫荧光显示，在博来霉素诱导的野生型小鼠肺中，α-SMA+Erdr1-成纤维细胞占大多数，而在Mbd2敲除的小鼠肺中，则多表现为α-SMA-Erdr1+。表明Erdr1可能抑制了成纤维细胞的分化。作者接下来用Erdr1慢病毒和模拟慢病毒转导成纤维细胞，并用TGF-β诱导，Western Blot结果显示，Erdr1慢病毒转导可明显降低成纤维细胞中纤连蛋白、Ⅰ型胶原和α-SMA的水平。相反，若用siRNA将Erdr1进行沉默，则成纤维细胞又恢复分化能力，表现为上述指标的显著增高。为进一步验证，作者考察了Erdr1慢病毒转导后TGF-β下游信号分子。Western Blot结果显示，Erdr1慢病毒转导显著抑制了TGF-β诱导的Smad2/Smad3磷酸化，而若用siRNA将其沉默，则消除了Mbd2敲除对成纤维细胞分化的抑制作用。以上结果均支持Erdr1在TGF-β诱导的成纤维细胞分化过程中起到了抑制作用。

Fig 8：最后，作者通过气管内注入Erdr1慢病毒来炎症Erdr1异位表达是否可有效抑制博来霉素诱导的肺纤维化。首先作者证实气管内注入慢病毒可使肺内Erdr1水平翻倍。然后，在博来霉素诱导后的第10天对小鼠进行Erdr1慢病毒的气管内注入。HE和Masson染色结果显示，Erdr1慢病毒气管内注入显著抑制了博来霉素诱导的肺纤维化。羟脯氨酸含量测定，纤连蛋白、Ⅰ型胶原以及α-SMA的Western Blot也显示了相同的结果。以上结果证实，Erdr1异位表达可有效逆转博来霉素诱导的肺纤维化。

在最后的通路图中，作者总结了MBD2在成纤维细胞分化中的作用。TGF-β通过 TβRI/Smad3依赖性的方式诱导MBD2高表达，而MBD2选择性地结合Erdr1启动子以抑制其表达。其中TGF-β与MBD2之间存在正反馈调节，促进了成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，进而导致肺纤维化。

原文链接：

https://erj.ersjournals.com/content/early/2021/12/16/13993003.03697-2020.long